神经系统遗传代谢病的实验室诊断

  神经系统遗传代谢病种类非常之多，缺乏特异性，临床诊断困难，许多疾病的预后效果取决于治疗开始的早晚，熟悉其临床相应症状，做到合理有效的检测，将有利于对新生儿和疾病初期患者确诊，疾病分型诊断，有效预防发病和尽快改善部分疾病的症状，减少伤残。

  研究员，专业方面技术二级，博士研究生导师，国务院特殊津贴专家，全国优秀科技工作人员，海南省领军人才。海南省细胞与分子遗传转化医学重点实验室主任，海南省细菌耐药检测中心负责人。中国遗传学会理事，海南省遗传学会理事长。白求恩精神研究会检验医学分会副会长，中国医疗保健国际交流促进会临床检验专业委员会副主任委员，中国医师协会检验医师分会常委，中国医院协会临床检验管理专业委员会常委，中国医学装备协会POCT装备技术分会常委，白求恩精神研究会检验医学分会第一届POCT专业委员会主任委员，中华医学会检验医学分会委员，国家细菌耐药检测专家学术委员会委员。中华检验医学等多家杂志编委。海南省医学会检验医学专业委员会第五、第六、第七届主任委员、第八届名誉主任委员，海南省医师协会检验医师分会会长，海南省医院协会医学检验管理专业委员会主任委员。海南省病原微生物实验室生物安全专家委员会主任委员。发表SCI、EI和中文核心期刊等论文220多篇，获省部级科技进步奖19项，主持国家自然科学基金，国家重点研发专项子项目和省部级科研课题二十余项。

  遗传代谢病（inborn errors of metabolism，IEM）是维持机体正常代谢所必需的多肽或蛋白构成的酶、受体、跨膜转运载体、神经递质及其相关辅因子等发生遗传缺陷所导致的一组疾病[1]。由于参与人体正常功能的酶、载体蛋白、膜或者受体等的编码基因发生突变，使其编码产物功能产生改变，导致机体生化代谢发生紊乱，从而发生一系列的临床病理症状。

  IEM可分为小分子病和大分子病，小分子病又可分为糖、氨基酸、脂肪酸、脂蛋白、核酸及激素代谢异常、有机酸血症及尿素循环障碍、神经递质和金属代谢异常等；大分子病又称细胞器病，如溶酶体贮积、线粒体、过氧化物酶体和高尔基体等。但两者之间界限并不绝对，有相互重叠[1]。目前有明确描述的IEM已有近千种之多，其中有80%以上会引起神经系统的功能缺损，以神经系统受累为主要临床表现的IEM又被称为神经系统遗传代谢病[2-3]。它们的临床表现可以多种多样，如程度不同的脑发育障碍、精神发育迟滞、无明显原因的癫痫发作、全身肌张力失调（如各种蛋白质营养不良症）、对称性的肢体瘫痪、感觉运动型多神经病等，还可以表现为精神错乱或行为异常（如自伤行为就是Lesch-Nyhan综合征的典型症状）等类型[4]。神经系统遗传代谢病临床表现复杂，症状轻重不一，同时还受饮食、药物、感染等外因的影响，常无特异性症状,诊断困难，易漏诊误诊，仅从临床症状和体征很难获得明确的病因诊断，在很大程度上依赖于实验室的辅助检查。

  神经系统遗传代谢病症状缺乏特异性，不同病种可表现出相似的临床症状，而同一病种也有可表现不同的表型，早期诊断困难。在基于临床症状做出诊断后，可先进行常规生化检测，如果初步筛查结果是阳性或是可疑，应该依据所怀疑的代谢障碍，进一步对血、尿或其他体液的氨基酸、脂肪酸或有机酸等做多元化的分析，根据结果再进行酶活性测定和基因检测，结合影像学结果，争取早期诊断、早期治疗。

  常规生化检验测试包含检测血常规、血氨、血糖、电解质、酮体、乳酸/丙酮酸比值、血气分析、AG、血脂分析、心肌酶谱、尿常规及尿酮、尿酸，尿显色分析等。遗传代谢病患者多种器官多系统受累，故常见尿色、味异常,血生化检测急、慢性代谢性酸中毒、高血氨、低血糖、酮中毒、高乳酸血症等。

  常规生化检测结果常可提示可能的疾病,如高锰血症提示锰转运蛋白缺陷，巨细胞性贫血提示维生素B12和叶酸代谢障碍，空泡样淋巴细胞提示溶酶体累积病，甘油三酯增高提示糖原累积病、脂蛋白病；铁、转铁蛋白和铜增高提示过氧化物酶体病，铜蓝蛋白降低提示肝豆状核变性、Menkes病等[5]。AG升高是有机酸积聚的一个重要指标，缺氧导致乳酸在体内积聚而引起的继发性酸中毒使AG升高，代谢性酸中毒伴AG升高时，常提示可能患遗传代谢病，如甲基丙二酸血症、丙酸血症、异戊酸血症等。血氨升高提示尿素循环功能不足，严重高血氨，可能为尿素循环缺陷、有机酸尿症、丙酸血症等[6]。血乳酸、丙酮酸以及血乳酸与丙酮酸比值反映细胞浆和线粒体氧化还原状态，血乳酸水平的判断应结合血糖分析。伴有低血糖存在的情况下，乳酸增高提示糖代谢、糖异生、脂肪酸氧化缺陷。不伴有低血糖的单纯乳酸升高提示电子传递链、三羧酸循环、丙酮酸脱氢酶缺陷[7]。某些代谢产物可使尿液呈现异常颜色或气味，尿液为蓝或蓝棕色时提示可能有尿蓝母、尿黑酸，为红色时提示有卟啉、吡唑酮、酚酞，为红棕色时提示有高铁血红蛋白或血红蛋白。尿液有鼠尿臭味提示可能为苯丙酮尿症，有焦糖味提示可能为枫糖尿症尿，有特殊汗脚味提示可能为异戊酸血症，酸败黄油味提示可能为Ⅰ型酪氨酸血症[5]。尿显色分析中，三氯化铁试验用于检测典型苯丙酮尿症、组氨酸血症、羟基犬尿酸尿症，2′4-二硝基苯肼反应用于检测苯丙酮尿症、枫糖尿症、组氨酸血症，偶氮对硝基苯胺试验用于检测甲基丙二酸血症，氰化硝普钠试验用于检测胱氨酸尿症、同型胱氨酸尿症呈阳性，十六烷基溴化铵反应、甲苯胺兰试验用于检测黏多糖贮积症[8]。

  神经系统遗传代谢病常导致氨基酸、有机酸、糖类、核酸类等多种代谢产物的异常，可通过对代谢产物的定量检测筛查相应病症。而传统的筛查方法，如细菌抑制法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附实验等，一次实验只能检测一种疾病，效率低下，不适用于开展广泛筛查。质谱技术的发展使IMD的筛查和诊断发生了革命性进展。使用气相色谱质谱技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和串联质谱技术（tandem mass spectrom-etry，MS-MS）可通过微量的血液和尿液能够直接进行上百种代谢产物的检测，一次可检测多种代谢物的改变，在筛查和诊断中发挥着重要作用。

  GC-MS原理是使用GC-MS仪的气相分离功能把尿中所含成分通过离子化，产生气态离子，在加热和载体氦气的携带下，通过毛细层析柱进行分离、溶出，经检出器检出以波峰的形式表达出来,一个波峰基本上代表一种成分,波峰的大小和强度代表该物质的量的多少。分离溶出的物质又进入质谱进行离子化，不同成分所含不同特殊的化学结构，经过处理后产生的离子结构和质量数不同，按质荷比大小经质量分析器分离后，再通过检测器响应获得质谱图。一种质谱只有一个化合物。

  1966年K-Tanaka首次应用气相色谱-质谱联用GC-MS技术检验测试尿液中的有机酸，发现3-羟基异戊酸异常，从而诊断了异戊酸血症[9]，GC-MS开始在遗传代谢病的筛查与诊断中大范围的应用。该方法取样简单，分析的尿液样本可以是原尿或滤纸尿标本，在有机酸萃取法中尿样经盐酸羟铵、氢氧化钠和盐酸处理肟化处理后，加入内标，乙酸乙酯萃取两次，氮吹至干，加入硅烷化试剂（BSTFA/TMCS）衍生化后进样分析，但只对有机酸敏感[10]。1992年，Isamu-Matsumoto将尿素酶前处理的方法一直在改进，建立了尿素酶预处理-气相色谱-质谱法（UP-GC-MS），在尿素酶法中，尿样经尿素酶去尿素后，加入内标，再加入无水乙醇，混匀后去蛋白，真空干燥，残余物用BSTFA/TMCS 衍生处理后进样分析，使样品预处理时间缩短，同时可分析氨基酸、有机酸、单糖、二糖、嘧啶和核酸类等多种异常代谢产物[11]。

  MS-MS指两个或更多的质谱连接在一起。质谱仪（MS）是一类能使分子转化成离子，并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后等，实现质荷比分离，检测强度后进行物质分析的仪器。最简单的串联质谱由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器将离子预分离或加能量修饰后由第二个质量分析器分析结果。与单级质谱相比，诱导第一级质谱产生的分子离子裂解，有利于研究子离子和母离子的关系，进而给出该分子离子的结构信息，从干扰严重的质谱中抽取有用数据，大幅度的提升质谱检测的选择性，从而能够测定混合物中的痕量物质。可以精确检测待测物中各种代谢产物的含量。

  20世纪90年代美国Milliton博士应用串联质谱法检测干燥滤纸血斑中的脂酰肉碱[12]，从而诊断20余种脂肪酸代谢异常疾病，将串联质谱联技术引入遗传代谢病检验测试领域，之后ＲASHED和CHACE对该技术进行了改良，使其可以同时检测筛查脂肪酸和部分氨基酸代谢异常，推动了全球性的新生儿筛查[13]。标本采集时使用干血滤纸片，采集空腹手指或足跟末梢血，滴于专用血滤纸上，自然晾干后送检。标本预处理加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的甲醇（衍生法需加入衍生试剂），提取血中的氨基酸和酰基肉碱，孵育一段时间后，氮气吹干并加入有机溶剂复溶，样本上机检测[13]。只需数滴血,就能在2～3min对一个标本进行几十种代谢产物分析，可有效协助诊断神经系统遗传代谢病。

  质谱法的优点是采样方便，所需样本量少，一次检测即可多种代谢物含量，并且灵敏快速，但也存在缺点，仪器、试剂昂贵，结果解读复杂，代谢物含量容易受药物和病情进展影响，将来还有很大的改良发展空间。

  酶活性检测通过测定酶蛋白活性，可确诊遗传代谢病。1952年Cori证实糖原累积病（Von Gierke）系葡萄糖-6磷酸酶缺陷引起,提出了酶检测诊断方法；我国“七五”及“八五”期间,北京协和医院遗传医学中心开展了溶酶体贮积症的酶学测定研究[14]，至今酶活性检测仍在遗传代谢病诊断中起到重大作用。

  酶具有高度的专一催化活性，故可通过测定其相应的底物或产物浓度变化，或用某一反应产物或反应物浓度变化来确定其酶的活性。可采集血清，肝肾组织，或体细胞（如白细胞,皮肤成纤细胞）做体外培养，采用微量的荧光底物或者人工合成的底物，用荧光分光光度计或普通分光光度计进行仔细的检测。如酸性麦芽糖酶提示糖原贮积症Ⅱ型，肌磷酸化酶提示糖原累积病Ⅴ型，α-半乳糖苷酶A提示法布里病（溶酶体贮积病），β-半乳糖脑苷酯酶提示克拉伯病（球细胞脑白质营养不良），芳基硫酯酶A提示异染性脑白质营养不良，酸性β葡萄糖脑苷脂酶提示戈谢病（葡糖脑苷脂病）等[15]，应用酶活性测定能够诊断黏多糖症（Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型）、糖原贮积症Ⅱ型、球型细胞脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、岩藻糖贮积症、黏脂贮积症，溶酶体贮积病，生物素酶缺乏症等多种遗传代谢病[8]。

  神经系统遗传代谢病多属于单基因遗传病，绝大多数为常染色体隐性遗传，也有少数为常染色体显性遗传、X连锁伴性遗传或线]，酶和结构的异常归根结底也是基因突变导致编码产物异常引起的，随着慢慢的变多神经系统遗传代谢病的致病基因被发现和测序技术的发展，高通量测序联合质谱分析愈来愈普遍地使用于神经系统遗传代谢病的诊断。

  新一代测序（Next Generation Sequencing，NGS） 技术，可对DNA分子进行大规模平行测序，对多样本，多基因，多外显子可同时检测，迅速得到检测结果，但是，由于IEM每个病种可能涉及多个基因，总的突变位点更多，需要针对各病种致病基因建立文库，步骤繁琐，诊断效率较低。因此，目前主张基于NGS技术开发相关致病基因Panel，基因PANEL是一个基因组合，指在检测中不只检测一个位点、一个基因。而是同时检测多个位点、多个基因、多个位点。这些位点和基因需要按照一个标准做选择和组合，从而构成一个检测组合，一次性可以检测多个基因。采集受检者静脉血（EDTA抗凝）后提取DNA，使用试剂盒进行外显子捕获，通过多重探针杂交方法靶向富集目标区域序列，进一步纯化建库后，上机测序（多使用Illumina Hiseq平台）。数据结果用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）软件将其定位到人类基因组的参考序列上，去除冗余信息后用GATK检测变异，通过ANNOVAR和VEP（Variant Effect Predictor）等软件从不同层面对变异进行注释，再参阅ACMG对变异的分类标准及基因是否在Clin Var/OMIM/HGMD中被报道为致病基因。确定后再采用Sanger测序做验证[18]。同时也可采集其父母的血样，用Sanger测序检测突变位点验证并研究遗传方式。

  NGS具有高准确性、高通量、高灵敏度的优势，它在早期、个性化诊断方面有着非常大的应用前景，可结合质谱法一起对IDM进行筛查，通过结果预测疾病的发生及发病的严重程度，会使更多的患者受益。也可用于有遗传代谢病家族史的家庭生育时进行产前诊断。

  神经系统遗传代谢病种类非常之多，临床表现复杂多样，且缺乏特异性，临床诊断困难，而许多疾病的预后效果取决于治疗开始的早晚，熟悉其临床相应症状，做到合理有效的检测，将有利于对新生儿和疾病初期患者确诊，疾病分型诊断，有效预防发病和尽快改善部分疾病的症状，减少伤残，甚至挽救生命。